Post-Dottorato. URLEG (Unità di Ricerca delle Leguminose a Seme), INRA di Dijon (Francia).

Un approccio di sub-proteomica é stato messo a punto allo scopo di identificare geni nucleari (es. fattori di trascrizione; modulatori della struttura della cromatina), espressi nelle fasi precoci di accumulo delle sostanza di riserva del seme di Leguminose ed potenzialmente correlabili con le sue qualità nutrizionali nelle piante modello Medicago truncatula e Pisum sativum. Un'analisi proteomica di elettroforesi mono-dimensionale (1DE) è stata combinata con quella di espressione genica di microarray per l'analisi dei trascritti lungo lo sviluppo del seme (dall'accumulo alla maturazione). Allo scopo di avere frazioni sub-cellulari arricchite in nuclei, si è messa a punto con successo una tecnica di purificazione basata sulla separazione differenziali di orfanelle endo-cellulari per saccarosio a partire da quantità elevate dei piccoli semi di M. truncatula. Le proteine associate alla frazione separata sono state estratte, separate tramite 1-DE e la loro identità probabile è stata attribuita tramite spettrometria di mass nanoLC-MS/MS, in collaborazione con la Piattaforma BIBS di spettrometria di massa (INRA di Nantes, Francia). In parallelo i profili di espressione di alcune proteine nucleari identificate e ritenute di interesse nel giocare un ruolo chiave nel controllo della qualità del seme sono state caratterizzate a livello di mRNA tramite RT-PCR quantitative lungo lo sviluppo del seme.

Dottorato di ricerca
Impatto delle micorrize arbuscolari sul proteoma e sulle popolazioni nucleari di pisello ( Pisum sativum) coltivato su suolo contaminato da cadmio (Inra de Dijon, Francia, http://www.dijon.inra.fr/pme/; all'Università degli Studi del Piemonte Orientale, Italia;).
All'INRA de Dijon e all'Università degli Studi del Piemonte Orientale, due approcci differenti (proteomica mirata e citometria a flusso, rispettivamente) hanno contribuito ad una migliore comprensione del ruolo svolto dalla simbiosi micorrizico-arbuscolare (AM) nei meccanismi di detossificazione/tolleranza nei confronti del metallo pesante cadmio (Cd) ai livelli proteico e nucleare in radici di pisello.
Gli effetti del Cd (100 mg Cd kg-1 substrato), applicato nel giorno del trapianto (Cd1) oppure 15 giorni dopo (Cd2) su due genotipi di pisello di diversa sensibilità al Cd ( Pisum sativum L., Cd-sensibile VIR4788 and Cd-tollerante VIR7128) ed inoculati e non con il fungo AM Glomus mosseae BEG12, sono stati studiati a quattro livelli: biomassa vegetale, sviluppo di G. mosseae, analisi differenziale di proteine radicali tramite elettroforesi mono- e bi-dimensionale (1-DE and 2-DE) e di popolazioni di nuclei radicali con differenti livelli di ploidia. La crescita dei due genotipi in presenza del Cd è avvenuta in modo differente: la biomassa del genotipo VIR4788 è stata ridotta dal Cd in modo significativamente maggiore rispetto a quella del VIR7128. Lo sviluppo intraradicale di G. mosseae è stato molto inibito dal Cd1, rivelando la particolare sensibilità del fungo AM durante le fasi precoci della simbiosi. La micorrizia ha alleviato la riduzione della crescita indotta dal Cd in modo più evidente nel genotipo Cd-sensibile. La proteomica ha per la prima volta dimostrato che la simbiosi AM modula l'espressione di proteine di radici coinvolte nelle risposte al Cd del genotipo VIR4788: 4 proteine sono state represse, mentre altre due sono state sovra-espresse nelle radici micorrizate trattate con il Cd. In particolare, un alcool deidrogenasi a catena corta insieme con una UTP-1-fosfato uridililtransferasi sono state identificate tramite 2-DE, spettrometria di massa in tandem con cromatografia liquida (LC-MS/MS) e tecniche di bioinformatica quali alcune delle 'proteine candidate' specificatamente indotte dal Cd ed altamente modulate da G. mosseae. Nelle radici differenziate, le analisi di citofluorimetria hanno per la prima volta dimostrato che cambiamenti nei livelli di ploidia rappresentano risposte di pisello nei confronti del Cd che sono modulate dall'interazione simbiotica nel solo genotipo VIR4788. In presenza del Cd, la simbiosi AM ha aumentato i nuclei 6C ed 8C nel genotipo Cd-sensibile in modo significativamente maggiore rispetto al genotipo Cd-tollerante. Questo aumento in ploidia potrebbe derivare da cambiamenti di livelli di trascrizione e/o traduzione indotti dall'interazione simbiotica.
In Italia, gli effetti del Cd (2.5, 25 and 250 M) sulla crescita della radice primaria, sull'indice mitotico (IM) e sulla morfologia dei cromosomi di meristemi apicali sono stati anche studiati durante le prime fasi di sviluppo radicale dei genotipi di pisello VIR4788, VIR7128 e cv. Frisson cresciuti in assenza di AM in soluzioni idroponiche. In generale, concentrazioni crescenti di Cd hanno diminuito la crescita della radice primaria, l'IM ed hanno causato delle irregolarità cromosomiche. L'attività dei meristemi apicali delle radici di pisello varia in funzione della sensibilità dei genotipi nei confronti del Cd. Il parametro IM si è dimostrato un buon indicatore per la valutazione dei gradi di sensibilità/tolleranza di genotipi di pisello verso basse concentrazioni di Cd, suggerendo un potenziale utilizzo di questa metodica nei programmi di selezione genetica.

Tirocinio annuale per l'iscrizione all'albo dei biologi
All'Università degli Studi del Piemonte Orientale, la possibile presenza di fenomeni di frammentazione regolata del DNA o apoptosi è stata analizzata in radici di pomodoro infette dal patogeno Phytophthora nicotianae var. parasitica. In particolare, su sezioni di meristemi sub-apicali di radici incluse in paraffina o in resina, si è utilizzato il test TUNEL come indicatore positivo di uno stato di cromatina frammentata, dopo avere controllato lo stato generale del DNA tramite l'utilizzo di vari fluorocromi (DAPI, PI, AO).
In parallelo, si è attivamente partecipato all'attività del laboratorio nell'ambito del Progetto Europeo INCO N° ERBIC18CT970180 "Reduction of the chemical inputs in a vegetable crop by the use of beneficial rhizospheric microorganisms, i cui principali obiettivi erano la messa in evidenza di eventuali fenomeni benefici indotti da microrganismi della rizosfera (funghi AM e batteri PGPR) da proporre come alternativa all'utilizzo di composti chimici tossici per l'ambiente. In particolare, il contributo ha interessato le prime fasi di messe a punto sperimentali riguardanti : i) la scelta dei più idonei terreni di crescita dei batteri e la selezione di alcuni isolati potenzialmente benefici per la pianta; ii) la dinamica di germinazione di spore AM in vitro e gli effetti indotti su di essa da plantule di pomodoro e/o batteri pseudomonadali; iii) la selezione delle più appropriate condizioni di crescita delle piante inoculate e non con il fungo AM G. mosseae, e infettate e non isolati di Pseudomonas fluorescens.

Tesi di Laurea
Effetti di simbiosi mutualistiche e/o patosistiche sull'attività e struttura dell'apice radicale in pomodoro
(Univ. Studi di Torino, II° Facoltà di Scienze MFN).
Relatore: Prof. G. Berta. 
Nell'ambito dei sistemi vegetali, radici di ordine diverso originano apparati radicali molto complessi e plastici, assolventi a funzioni di primaria importanza per la pianta, e il cui sviluppo, eterogeneo nel tempo e nello spazio, dipende dall'attività meristematica delle regioni apicali: la struttura e l'attività degli apici radicali hanno, infatti, un ruolo fondamentale nel determinare la morfologia e quindi la funzionalità dell'intero sistema radicale. Gli apici radicali sono la sede di specifiche reazioni biosintetiche e fisiologiche, la cui "driving force" è fornita dall'energia respiratoria; il loro grado di attività metabolica è determinato dalla particolare fisiologia, anatomia e morfologia del sistema, e risponde rapidamente a fattori biotici e abiotici. Nell'instaurarsi delle simbiosi mutualistiche micorrizico-arbuscolari (AM) a livello delle radici, il fungo penetra la parete cellulare dell'ospite e sviluppa un contatto intimo con il protoplasto della pianta, che, in risposta a tale ingresso, varia il suo metabolismo basale. Tra l'ospite vegetale e il micosimbionte si stabilisce un dialogo a livello genomico che porta a cambiamenti strutturali, morfologici e metabolici dei tessuti radicali della pianta, accompagnati da variazioni della loro organizzazione cellulare e macromolecolare. Ulteriori modificazioni cellulari e molecolari in sede radicale sono attribuite alle reazioni di difesa da funghi patosistici, che bloccano in modo localizzato lo sviluppo del patogeno tramite l'induzione nell'ospite vegetale di specifiche vie sintetiche.
L'obiettivo del lavoro è stato mettere in evidenza differenze nella struttura, nelle attività meristematiche e metaboliche delle regioni apicali del sistema radicale di Lycopersicon esculentum Miller, individuare eventuali variazioni attribuibili alla simbiosi mutualistica con il fungo AM Glomus mosseae (Nicol e Gerd) Gerdman, alla simbiosi patosistica con il patogeno Phytophthora nicotianae var. parasitica Breda De Haar, e ad entrambe le simbiosi contemporaneamente, ricercando il ruolo svolto dall'apice nei noti meccanismi di controllo biologico esercitati dalla simbiosi AM.
Per spiegare l'eterogeneità fisiologica delle regioni apicali è stato modificato un saggio citochimico specifico per l'attività della succinato deidrogenasi mitocondriale, e si è utilizzato un sistema d'analisi d'immagine allo scopo di quantificare le variazioni di attività respiratoria, confrontate, poi, con i relativi gradi di attività mitotica meristematica.
La morfologia esterna degli apici radicali e l'organizzazione cellulare dei meristemi apicali sono risultate invariate in presenza dei simbionti. In seguito all'infezione micorrizica si è riscontrato un aumento della lunghezza dell'apice e del meristema apicale e un netto incremento del diametro apicale, e conseguentemente del diametro dell'intera radice. Tali modificazioni sono apparse convalidate da variazioni delle relative attività apicali: G. mosseae ha sempre aumentato il grado di attività respiratoria apicale, anche in presenza del patogeno, senza determinare, però, modificazioni a carico dell'attività mitotica meristematica. All'opposto, P. parasitica, non ha causato variazioni dimensionali delle regioni apicali, mentre ha, invece, determinato diminuzioni delle relative attività mitotica e respiratoria apicali.
L'apice radicale è risultato, dunque, indirettamente coinvolto nei meccanismi di resistenza al patogeno: l'aumentato spessore della regione corticale invasa da G. mosseae viene a creare una barriera alla diffusione di P. parasitica, sia verso il cilindro centrale sia verso l'apice; il fungo patogeno è, infatti, raramente presente nelle stesse zone in cui si trova il fungo micorrizico, ed è escluso dalle cellule contenenti le tipiche strutture arbuscolari. La resistenza indotta da G. mosseae nei confronti di P. parasitica trova conferma nella maggiore vitalità degli apici, che vengono, così, preservati dalla malattia. L'effetto esercitato dalla micorrizia sulla regione apicale si traduce, quindi, in un effetto a lunga distanza che interferisce con la resistenza sistemica e coopera con la resistenza localizzata manifestantesi a livello cellulare.